کشت وتکثیر باکتریها در محیط های مصنوعی از مهمترین روشهای تشخیصی در باکتر ی شناسی است . برای کشت موفق باید شرایط مناسب برای رشد باکتری فراهم گردد. ازجمله این شرایط مواد غذایی- حرارت-رطوبت کافی- نمک- PH مناسب- حضور یاعدم حضوراکسیژن می باشد. محیط های كشت را متناسب با نوع آزمایش می‏توان به دو صورت مایع و جامد تهیه كرد. 

۱- محیط كشت مایع :

 محیط های مایع به علت نداشتن آگار در تركیب خود به صورت جامد در نیامده و متناسب با نوع میكروارگانیسم و آزمایشهای مورد نظر می‏توان آنها را در لوله‏های آزمایش ـ ارلن مایر و یا ظروف دیگر مورد استفاده قرار داد.

۲.محیط كشت جامد :

 محیط های جامد  به علت دارا بودن آگاردر تركیب خود به صورت جامد بوده و متناسب با میكروارگانیسم ها و آزمایش های مورد نظر می‏توان آنها را در لوله - ظروف پتری(پلیت)و یا ظروف دیگر مورد استفاده قرار داد . البته محیط های نیمه جامد نیز وجود دارد.که میزان آگار آن نسبت به محیط های جامد کمتر است.مثل SIM

كشت های جامد در لوله را می‏توان به صورتهای زیر تهیه كرد :

۱. کشت های عمقی Stab Cultures :

حدود 5 الی 10 میلی لیتر از محیط كشت را در لوله آزمایش ریخته و به طور عمودی می‏گذارند تا محیط بسته شود. سپس میكروارگانیسمها را توسط سوزن كشت(آنس) به طور عمقی در مركزاین محیط كشت می‏دهند . 

۲.كشت در داخل محیط جامد Shake Cultures:

به لوله‏های آزمایش محتوی محیط كشت جامد پس از ذوب شدن كه تا 45 درجه سلسیوس سرد شده است. باكتری مورد نظر را افزوده و لوله را بین دستها تكان می‏دهندتا باكتریها كاملا با محیط كشت مخلوط شوند , سپس لوله آزمایش را به طور عمودی قرار می‏دهند تا محیط بسته شود . 

۳.  كشت شیب دار Slant  Cultures:

حدود 5 میلی لیتر از محیط كشت جامد (ذوب شده) در لوله آزمایش و یا لوله‏های كوچك دیگر ریخته می‏شود و پس از سترون كردن آنها را به صورت كج به گونه‏ای می‏خوابانند كه سطح محیط كشت شیب دار باشد . 

 میكروارگانیسمها را با سوزن كشت(آنس) در عمق و سطح و یا به وسیله فیلدوپلاتین نوك  حلقه‏ای ( لوپ ) در سطح شیب دار كشت می‏دهند.

كشت جامد در پلیت به سه صورت انجام می‏گیرد :

۱.كشت خطی در سطح محیط های جامد در ظرف پتری:

با این روش می‏توان میكروارگانیسم را بطور خطی توسط فیلدوپلاتین نوك حلقه‏ای (لوپ) در سطح محیط جامد كشت داد.

۲.  كشت در سطح محیط :

 در این روش توسط پی پت مقداری از رقت معینی از میكروارگانیسم را در سطح محیط جامد ریخته و با میله پخش كننده , كاملا در سطح محیط می‏گسترانند . 

۳.  كشت های دو لایه :

در این روش كشت مایع باكتری (سوسپانسیون باكتری) به محیط كشت ذوب شده (حرارت 45 درجه سلسیوس ) افزوده می‏شود. در صورت لزوم باكتری را با لایه نازكی از همان محیط كشت می‏پوشانند و پس از بسته شدن محیط ظرفهای پتری را به طور واژگون در گرمخانه قرار می‏دهند تا از ریختن قطرات آب درسطح محیط جلوگیری گردد . 

انواع محیط های كشت:

محیط های كشت را از نظر تركیب شیمیایی و دارا بودن مواد غذائی یا مواد باز دارنده می‏توان به چند دسته تقسیم كرد . 

 ۱. محیط كشت انتخابی (Selective) :

 این محیط ها برای جدا كردن یك یا دسته‏ای از میكروارگانیسم‏ها بكار می‏روند و به علت دارا بودن مواد بازدارنده، از رشد میكروارگانیسم‏های ناخواسته جلوگیری می‏كنند مانند محیط  برد باركر جهت جدا كردن استافیلوكوكوس اورئوس و یا محیط S.S برای سالمونلا و شیگلا و یا محیط دارای نمک های صفراوی برای جدا كردن كلی فرمها .

2.محیط های كشت غنی كننده (Enrichment) :

 این محیط ها معمولا در مواردی به كار می‏روند كه تعداد میكروارگانیسم مورد جستجو   درنمونه غذائی كم بوده و یا به علت وجود زیاد میكروارگانیسم‏های دیگر جدا كردن آن با اشكال مواجه باشد.این محیط ها با تركیب خاص خود از نظر pH و مواد غذائی امكان رشد برای میكروارگانیسم مورد نظر را فراهم می‏كند،مانند محیط گوشت پخته برای جدا كردن استافیلوكوكوس اورئوس . 

۳.محیط های كشت افتراقی (Differential) :

 محیط هایی هستند كه میكروارگانیسم‏های مختلف در آن ویژگیهای خاص خود را نشان می‏دهند , مانند محیط های خون دار كه در آن نمونه‏های همولیتیك و غیر همولیتیك از هم جدا می‏شوند .و محیط مك كانكی آگار كه در آن كلی فرمهای تخمیر كننده لاكتوز پرگنه‏های قرمز می‏دهند . در حالی كه باكتریهای روده‏ای كه قادر به تخمیر لاكتوز نیستند مانند سالمونلا پرگنه‏های بی رنگ به وجود می‏آورند . 

معرفی برخی از محیط های کشت مورد استفاده:

1. Blood agar

محیط کشت آگار خوندار یکی از محیط های کشت مغذی است که رشدبسیاری ازباکتری ها راتامین می کند وهمچنین ایجاد همولیز برروی این محیط به راحتی قابل بررسی است. برای تهیه این محیط پس ازتهیه آگار پایه لازم است محیط چهل تا پنجاه درجه سانتیگراد خنک شود. دراین مرحله پنج میلی لیتر خون تازه به ازای هرصد میلی لیتر محیط افزوده وپس از مخلوط کردن درپلیت های استریل تقسیم کنید.در این محیط برخی دارای همولیز آلفا(ناقص)و برخی بتا(کامل) و برخی گاما(فاقد همولیز)میباشند .نوع همولیز استاف اورئوس بتا میباشد یعنی همولیز کامل.این محیط محیط مناسبی برای هموفیلوس ها نیز می باشد

2. E.M.B

ائوزین متیلن بلو آگار نوعی محیط کشتی است كه برای تشخیص و جداسازی باكتری های میله ای روده ای گرم منفی استفاده می شود. همچنین ائوزین متیلن بلو آگار مانع از رشد باكتری های گرم مثبت می شود.ولی برخی گرم مثبت ها مانند استافیلوکوک های گواگولاز مثبت و برخی مخمر ها (کاندیدا آلبیکنس) می توانند در این محیط رشد کنند. مبنای افتراق در این محیط بكارگیری دو رنگ شاخص یعنی ائوزین و متیلن بلواست كه متمایزكننده تخمیركننده های لاكتوز ازارگانیسمهای فاقد توانایی تخمیر لاكتوز می باشد. در این محیط باكتری های تخمیر كننده لاكتوز دارای كلنی هایی قرمز پر رنگ و ارغوانی تا بنفش خواهند بود در حالیكه ارگانیسم هایی كه نمی توانند لاكتوز را تخمیركنند كلنی های كاملا بی رنگ یا هم رنگ محیط  خواهند داشت.E.coliدر این محیط جلای سبز فلزی خواهد داشت.

3.Hekton  Enteric agar

هكتون انتریك آگار محیطی انتخابی برای جداسازی و ترمیم نمونه های مدفوعی متعلق به باكتری های روده ای به ویژه سالمونلا و شیگلا است. این محیط  باكتری های تخمیركننده لاكتوز را از آنهایی كه نمی توانند از تخمیر لاكتوز ، اسید تولید كنند با ایجاد رنگ زرد - نارنجی روی محیط مناسب در حضور شاخص pH متمایز می كند . باكتری هایی كه لاكتوز راتخمیر نمی كنند، روی محیط تغییر رنگ ایجاد نمی دهند. هكتون انتریك آگارمی تواند تولید گاز هیدروژن سولفید را با تیره نمودن بخش هایی از محیط  نشان دهد.

4. Mackonkey agar

مك كانكی آگار محیطی جامد برای متمایز كردن جمعیت زیادی ازمیكروبها است.این محیط اهمیت كاربردی زیادی در شناسایی تخمیركننده های لاكتوز، پاتوژن های روده ای گرم منفی دارد.این محیط شامل پپتون, بافر,لاکتوز,کریستال ویوله,املاح صفرابی و معرف نوترال رد است که مانع رشد باكتریهای گرم مثبت می شود. كلنی باكتری های تخمیركننده لاكتوز،محیط را به رنگ قرمز درمی آورند.رنگ قرمز درنتیجه ایجاد محیط اسیدی بوسیله تخمیر كننده های لاكتوز شكل می گیرد.ارگانیسم هایی كه نمی توانند لاكتوز را تخمیر كنند، سبب تغییر رنگ نمی شوند.در واقع همرنگ با محیط می شوند.

5.Mannitol salt agar

یك  محیط انتخابی برای تمایز استافیلوكوكهای پاتوژن مانیتول سالت آگار است. غلظت بالای نمك(7.5%) در این محیط مانع از رشد بیشتر میكروارگانیسمها می شود.نه تنهااستافیلوكوك های پاتوژن می توانند در این محیط رشد كنند بلكه آنها در این محیط اسید هم تولید می كنند.این اسید تولید شده به عنوان شاخصpH موجب تغییر رنگ محیط از قرمز به زرد می شود. استافیلوكوك های غیر باتوژن نیز قادر به رشد در این محیط هستند ولی نمی توانند اسید تولید كرده رنگ آن را تغییر دهند.

محیط های کشت تنوع بسیار زیادی دارند که تنها به چند مورد از آنها در این بخش اشاره شد.

خصوصيات برخي از محيطهاي مصنوعي كه به طور معمول مورد استفاده قرار مي‌گيرد.

1) باكتروئيدس بايل اسكولين آگار (BBE)

BBE  آگار جهت جداسازي سريع و شناسائي احتمالي گروه باكتروئيدس فراجيليس مفيد مي‌باشد.

اين محيط داراي mg/ml100 جنتامايسين، كه رشد بيشتر ارگانيسم‌هاي هوازي را مهار مي‌كند، 20% صفرا، كه رشد اغلب بيهوازيها را مهار مي‌كند (به جز باكتروئيدس فراجيليس و تعداد كمي از ساير گروهها) و اسكولين، كه به تشخيص گروه باكتروئيدس فراجيليس كه معمولاً اسكولين مثبت هستند كمك مي‌كند، مي‌باشد.

2) آگار خوندار(BLOOD AGAR)

اين محيط از يك پايه مانند تريپتون كه منشاء پروتئيني دارد، هضم شده پروتئيني سويا (كه داراي مقدار كمي از كربوهيدراتهاي طبيعي است)، كلريد سديم، آگار و 5 درصد خون تشكيل شده است.

3) محيط BHI

محيط غني از مواد مغذي ديگر محيط BHI مي‌باشد، كه جهت رشد بسياري از ميكروارگانيسم‌ها مي‌توان از آن استفاده نمود. اين محيط را مي‌توان به صورت آبگوشت (BHI Broth) يا سخت شده بوسيله آگار (BHI agar)، با يا بدون اضافه كردن خون مورد استفاده قرار داد.

د) شكلات آگار

در ساختن اين محيط از پايه آگار خوندار استفاده مي‌شود. پس از آماده نمودن و استريل كردن محيط پايه گلبولهاي قرمز را هنگامي كه هنوز محيط داغ است (در حدود 85 درجه سانتيگراد) به آن اضافه مي‌كنيم. گلبولهاي قرمز در اين حالت ليز شده و محيط رنگ شكلاتي – قهوه اي به خود مي‌گيرد. اكنون هموگلوبين و ساير مواد مغذي موجود در گلبولهاي قرمز در محيط وجود دارند. هِمين (hemin) كه فاكتور X خوانده مي‌شود، و كوآنزيم نيكوتين آدنين دي نوكلئوئيد (NAD)  كه فاكتور V خوانده مي‌شود، به عنوان مكمل به محيط پايه آگار غني از مواد مغذي اضافه مي‌گردند. نايسريا گنوره و گونه‌هاي هموفيلوس در ميان ساير ارگانيسم‌هاي سخت رشد، رشد بهتري در حضور مواد مغذي مكمل اضافه شده به شكلات آگار دارند.

4)  Chopped meat broth

اين محيط با يا بدون اضافه كردن گلوكز، جهت غني سازي و محافظت از رشد ارگانيسم‌هاي بيهوازي مورد استفاده قرار مي‌گيرد. تكه‌هاي گوشت سوبستراهاي خوبي جهت آنزيم‌هاي پروتئوليتيك بوده و به عنوان يك عامل احياء كننده جهت حفظ پتانسيل پايين اكسيداسيون – احيا عمل مي‌كند.

5) كلمبيا CAN آگار با خون

محيط پايه كلمبيا آگار يك محيط غني از مواد مغذي بوده و داراي سه منبع پپتون مي‌باشد. اضافه كردن 5 درصد خون دفيبرينه محيط را مغذي نموده و واكنشهاي هموليتيك را به خوبي نشان مي‌دهد. عوامل ضد باكتري كوليستين (10 ميكروگرم در ميلي ليتر) و ناليديكسيك اسيد (15 ميكروگرم در ميلي ليتر) به طور كامل رشد  انتروباكترياسه‌ها و گونه‌هاي سودوموناس را مهار كرده، در صورتيكه استافيلوكوك استرپتوكوك و انتروكوك به راحتي رشد مي‌كنند، برخي از ارگانيسم‌هاي گرم – منفي مانند گاردنرلا واژيناليس و برخي از گونه‌هاي باكتروئيدس مي‌توانند بر روي محيط كلمبيا آگار با CAN و خون به خوبي رشد نمايند.

6) آبگوشت گرم – منفي

آبگوشت گرم – منفي (GN broth) يك محيط انتخابي بوده و جهت كشت سالمونلا و شيگلا از نمونه‌هاي مدفوع و سواب ركتوم مورد استفاده قرار مي‌گيرد. آبگوشت GN داراي چند تركيب فعال مي‌باشد. ستيرات سديم، به عنوان منبع كربن، دزوكسي كولات سديم (يك نمك صفراوي) ارگانيسم‌هاي گرم – منفي را تخريب نموده و از رشد اوليه كلي فرمها ممانعت به عمل مي‌آورد. اضافه نمودن مانيتول با غلظتي بيشتر از دكستروز رشد پاتوژنهاي تخمير كننده مانيتول را تقويت نموده و رشد گونه‌هاي پروتئوس را تضعيف مي‌كند. محيط جهت حفظ pH طبيعي، حتي بعد از توليد متابوليت‌هاي اسيد بوسيله باكتريها، با فره شده است.

7) هكتون اينتريك آگار (HE)

اين محيط يك نمونه از محيطهاي آگار انتخابي – افتراقي است كه جهت استريليزاسيون احتياجي به اتوكلاو كردن ندارد. غلظت نمك‌هاي صفراوي و رنگ‌هاي بروموتيمول بلووفوشين اسيدي به اندازه كافي جهت ممانعت از رشد بيشتر فلور طبيعي مدفوع بالاست. اين محيط فقط اندكي از رشد گونه‌هاي سالمونلا و شيگلا ممانعت به عمل مي‌آورد. به دليل آنكه تعداد معدودي از ارگانيسم‌ها قادر به رشد بر روي اين محيط هستند، قبل از تقسيم كردن در پليت احتياج به اتوكلاو كردن ندارد. ارگانيسم‌هاي تخمير كننده لاكتوز (لاكتوز-مثبت) با پايين آوردن pH محيط در محيط اطراف كلني، كلني‌ها را زرد رنگ مي‌كنند، اضافه كردن  فر يك آمونيوم سيترات، منبع آهن در بسياري از محيط‌هاي كشت، موجب توليد H₂S از تيوسولفات سديم شده و با تشكيل يك رسوب سياه رنگ در اطراف كلني توليد H₂S را مشخص مي‌كند.

8) Kanamycin-Vancomycin Laked rabbit blood agar KVLB

آگار يك محيط كشت انتخابي جهت جداسازي گونه‌هاي باكتروئيدس مي‌باشد اين محيط حاوي 75 ميكروگرم در ميلي ليتر كانامايسين است.

9) لونشتين – جانسون

 برای جدا سازی میکروب سل از آن استفاده میکنیم

10) مك كانكي آگار (Mac conkey agar)

مك كانكي آگار معمولترين محيط كشت آگار انتخابي – افتراقي بوده و داراي رنگ كريستال ويوله جهت ممانعت از رشد باكتريهاي گرم – مثبت و انديكاتور pH قرمز خنثي (Neutral red) جهت نشان دادن خصوصيات افتراقي مي‌باشد. باسيل‌هاي گرم منفي به آساني بر روي اين محيط رشد نموده و باكتريهاي تخمير كننده لاكتوز، محصولات اسيدي توليد نموده كه سبب كاهش pH در محيط اطراف كلني مي‌گردد. انديكاتور قرمز خنثي در pH اسيدي قرمز رنگ مي‌شود. پس ارگانيسم‌هاي لاكتوز – مثبت قرمز رنگ و لاكتوز – منفي بي‌رنگ و شفاف هستند. مك كانكي آگار محيط انتخابي و افتراقي مورد استفاده جهت گونه‌هاي شيگلا مي‌باشد. 

11) ميدل بروك آگار و براث Middlebrook agar and broth

؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟/

12) فنيل اتيل الكل آگار (PE agar)

با اضافه نمودن فنيل اتيل الكل به يك پپتون و محيط پايه عصاره گوشت (beef extract) آگاري ايجاد مي‌شود كه از رشد باكتريهاي گرم – منفي جلوگيري مي‌كند. اضافه كردن 5 درصد خون گوسفند مواد مغذي لازم جهت رشد استافيلوكوكها را فراهم مي‌آورد. اين محيط همچنين جهت كشت ارگانيسم‌هاي گرم – منفي كه الكل رشدشان را متوقف نمي‌كند، مورد استفاده قرار مي‌گيرد. پس از آماده كردن پليت‌هاي فنيل اتيل الكل آگار از آن بوي گل رز به مشام مي‌رسد.

13) PPLO agar (قبلاً Pleuro pneumonia – Like organism يا PPLO ناميده مي‌شد)

يك محيط غني شده است كه جهت ميكوپلاسماها مورد استفاده قرار مي‌گيرد. آگار اين محيط نسبت به ساير محيط‌هاي باكتريولوژي كمتر بوده و در  pH اندكي بالاتر تهيه مي‌شود. Beef heart in fusion، پپتون و اضافه كردن مواد مغذي مانند سرم و مايع آسيت به ميكوپلاسماها امكان رشد داده و كلني‌هائي با اندازه كوچك و مركز متراكم بر روي اين محيط ايجاد مي‌كنند. پني‌سيلين و كريستال ويوله را مي‌توان جهت جلوگيري از رشد باكتريهاي آلوده كننده به اين محيط اضافه نمود.

14) سابورودكستروز آگار

جهت كشت قارچهاي پاتوژن مورد بهره‌برداري قرار گرفته و خصوصاً جهت كشت عوامل قارچي سطح پوست مفيد است. اضافه نمودن عوامل ضد ميكروبي سيكلوهگزاميد (5/0 ميكروگرم در ميلي ليتر) و كلرامفنيكل (16 ميكروگرم در ميلي ليتر). 

15) آگار انتخابي استرپتوكوك

اين محيط، تغيير يافته محيط آگار خوندار بوده و حاوي كريستال ويوله، تري‌متوپريم-سولفامتوكسازول و كوليستين با غلظت مناسب جهت ممانعت از رشد اغلب استرپتوكوكها به غير از استرپتوكوك پيوژنزو استرپتوكوك آگالاكيته مي‌باشد. هموليز بتا بروي اين محيط به آساني قابل مشاهده است. اين محيط جهت كشت اوليه سواب گلو جهت تشخيص استرپتوكوك گروه A بسيار مفيد است.

16) تاير – مارتين آگار

اين محيط همان محيط شكلات آگار تغيير يافته است و جهت كشت نايسرياهاي پاتوژن به كار مي‌رود. آنتي‌بيوتيك‌هائي مانند كوليستين (جهت ممانعت از رشد ساير باكتريهاي گرم – منفي)، وانكومايسين (جهت ممانعت از رشد باكتريهاي گرم – مثبت) و نيستاتين يا انيزومايسين (جهت ممانعت از رشد مخمرها) به محيط اضافه مي‌شود. در تاير  مارتين آگار از نيستاتين جهت ممانعت از رشد مخمرها استفاده مي‌شود. محيط تغيير يافته تاير – مارتين (MTM) داراي تري متوپريم جهت ممانعت از رشد پروتئوس مي‌باشد.

17) تيوگليكولات براث

اين آبگوشت غني كننده به طور معمول در آزمايشگاههاي ميكروبشناسي مورد استفاده قرار مي‌گيرد. مقدار آگار موجود در محيط تيوگليكولات 075/0 درصد بوده و اين مقدار آگار جهت جلوگيري از ورود جريان اتمسفر حاوي اكسيژن به داخل آبگوشت استفاده شده است. تيوگليكوليك اسيد به عنوان يك عامل احياء كننده جهت پايين آوردن پتانسيل اكسيداسيون احياء در محيط استفاده شده است. با اضافه نمودن تعداد زيادي از فاكتورهاي مغذي مانند كازئين – عصاره مخمر، گوشت، و ويتامين‌ها و غيره به اين محيط، رشد اكثر باكتريهاي پاتوژن تشديد مي‌گردد. ساير مكمل‌هاي غذايي، انديكاتور اكسيداسيون-احياء (Resazorin)، دكستروز، ويتامين K₁ و هِمين (hemin) در فرمولهاي تغيير يافته ديگر به محيط اضافه شده است. تكنولوژيست‌ها در اين محيط مي‌توانند تفاوت بين انتشار باكتريها در محيط را مشاهده نمايند. باسيل‌هاي گرم-منفي اختياري در سراسري محيط پخش مي‌شوند، كوكسي‌هاي گرم – مثبت به صورت توپ باد كرده (puff ball) رشد مي‌كنند و هوازيهاي مطلق مانند سودوموناس و مخمرها به صورت يك لايه نازك در سطح آگار رشد مي‌نمايند. جهت رشد باكتريهاي بيهوازي اگر به محيط تيوگليكولات مكمل هِمين (hemin) به مقدار 5 ميكروگرم در ميلي ليتر و ويتامين K₁ به ميزان 1/0 ميكروگرم در ميلي ليتر و بيكربنات سديم به ميزان 1 ميلي گرم در ميلي ليتر اضافه گردد نتايج بهتري حاصل مي‌گردد.

18) محيط تريكوموناس

جهت جداسازي تك ياخته‌ها مورد استفاده قرار گرفته است. اين محيط داراي آنتي بيوتيك كرامفنيكل جهت ممانعت از رشد باكتريهاي آلوده كننده مي‌باشد. pH حدود 6 است

19) گزيلوز – ليزين – دزوكسي كولات آگار (XLD)

XLD آگار مانند هكتون اينتريك آگار يك محيط انتخابي جهت رشد شيگلا و سالمونلا بوده و احتياجي به استريليزاسيون توسط اتوكلاو ندارد. نمك‌هاي صفراوي از رشد بسياري از انتروباكترياسه‌ها و كوكسي‌هاي گرم-مثبت ممانعت به عمل مي‌آورند. انديكاتور فنل رد جهت تمايز باكتريهاي لاكتوز-منفي (سالمونلا و شيگلا) كه كلني آنها به صورت بي‌رنگ يا صورتي كم رنگ در مي‌آيد به محيط اضافه شده است. فريك آمونيوم ستيرات جهت مشاهده توليد H₂S توسط ارگانيسم‌هاي H₂S – مثبت به محيط اضافه شده است. در صورت توليد H₂S مركز كلني تيره مي‌گردد. ارگانيسم‌هائي كه كربوهيدراتهاي موجود در محيط را تخمير مي‌كنند (گزيلوز لاكتوز و سوكروز) كلني‌هاي زرد رنگ توليد مي‌كنند.