باکتریهای هوازی
باکتریهایی هستند که درفقدان مولکول اکسیزن قادربه رشد نمی باشند. این باکتریها به راحتی درهوای اتاق رشد می نمایند وانکوباتورهای معمولی به راحتی رشد آنهاراتامین میکنند
باکتریهای بی هوازی اجباری
باکتریهای هستند که فقط درشرایط فاقدمولکول اکسیژن قادر به رشد میباشند. بسته به میزان حساسیت این گروه به اکسیژن می توان از روشهای متفاوت برای تامین شرایط موردنیاز رشد آنهااستفاده کرد.
ازجمله روشهای معمول انکوباتورهای بی هوازی هستند که هوای داخل انکوباتور بامخلوطی ازگازهای نیتروژن هیدروژن ودی اکسیدکربن جایگزین می گردد. همچنین می تواندازگازپک مخصوص بی هوازی جهت تولید شرایط عدم حضور اکسیژن استفاده کرد
GAS PACK
گاز پک توسط اسکات درآمریکا ساخته شده دراین سیستم ازیک جار بی رنگ پلاستیکی با یک درپوش محکم استفاده شده است. این گازپک هااغلب باعث تولید هیدروژن ودی اکسید کربن می شوند که هیدروژن درحضور کاتالیزورموجود در درب جار ترکیب شده وبه صورت قطرات آب درجداره ظرف ظاهرمی شود. همچنین دراین واکنش فشار داخل جار افت می کند که این دوعلامت میتواند به عنوان نشانه ای ازعملکردخوب گاز پک مطرح باشد.
برای تایید قطعی وحتمی می توان از اندیکاتورهای شیمیایی نیزاستفاده کرد. امروزه دربین اندیکاتورهای شیمیایی متیلن بلو رایج ترین اندیکاتورمی باشد که درحضوراکسیژن به رنگ آبی ودرعدم حضوراکسیژن احیاشده و بیرنگ میگردد
روش کار
برای انجام آزمایش پاکت را باز کرده ودرجار حاوی پلیتهای کشت داده شده قرار داده و10سی سی آب مقطر رابه داخل پاکت اضافه کنید. اندیکاتورراباز کرده ودرداخل جار قراردهید درب جار رامحکم بسته پس ازچندقیقه گرماداخل جارتولیدمی شود. این گرما بالمس کردن درب جارمشخص می شود. تولید قطرات آب در جداره جارنشانگر عملکرد خوب کاتالیزوروحذف اکسیژن است پس از مدت یک تادوساعت فعالیت کاتالیزور کم می شود
نکته: ابتدا اندیکاتوردرمجاورت اکسیژن به رنگ بنفش درخواهدآمد. درصورتی که جارفعال باشداندیکاتوربه مرور زمان بی رنگ خواهدشد.
نکته: برای فعال کردن مجدد کاتالیزور کافی است آنرااتوکلاو نماییم یابر روی چراغ حرارت دهیم
نکته: درمحیط بایل اسکولین آگار علاوه بر اسکولین ومواد صفراوی سدیم آزید(NaN3) نیز برای جلوگیری ازرشدباکتریهای گرم منفی به کاررفته است ومعرف رنگی محیط سیترات فریک می باشد
تعیین تعداد باکتری:
روشهای متعددی وجود دارد که ازآنجمله می توان به روش شمارش کلنی وکدورت سنجی اشاره کرد .روش کدورت سنجی ازساده ترین روشهای تعیین تعداد باکتری ها درسوسپانسیون باکتری است .برای سنجش کدورت سوسپانسیون می توان کدورت آن راتوسط دستگاه توربیدومتر اندازه گیری وباجداول مربوطه مقایسه وتعداد باکتری رااعلام نمود ویا کدورت سوسپانسیون را باکدورتهای استاندارد بطورماکروسکوپی توسط چشم مقایسه نمود
Mac Farland Nephelometery Standards لوله های مک فارلند را می توان با کمک مخلوط نمودن اسید سولفوریک 1 درصد وکلرید باریم 1 درصد (یک گرم در 100 سی سی آ ب مقطر) براساس جدول زیر تهیه نمود
|
10 |
9 |
8 |
7 |
6 |
5 |
4 |
3 |
2 |
1 |
|
|
1ml |
./9ml |
./8ml |
./7ml |
./6ml |
./5ml |
./4ml |
./3ml |
./2ml |
./1ml |
کلرید باریم
|
|
9ml |
9/1ml |
9/2ml |
9/3ml |
9/4ml |
9/5ml |
9/6ml |
9/7ml |
9/8ml |
9/9ml |
اسید سولفوریک
|
|
30 |
27 |
24 |
21 |
18 |
15 |
12 |
9 |
6 |
3 |
تعدادتقریبی
|
برقراري شرايط اتمسفري لازم جهت رشد پاتوژنها بجز باكتريهاي بيهوازي
ارگانيسمهاي پاتوژن يا هوازي هستند، از اكسيژن به عنوان پذيرنده نهائي الكترون استفاده ميكنند و رشد خوبي در اتمسفر هواي اتاق دارند، يا بيهوازي هستند كه قادر به تحمل اكسيژن محيط نيستند و يا ميكروآئروفيل هستند، رشد بهتري در فشار كم اكسيژن دارند. ارگانيسمهاي هوازي را ميتوان بدون مشكل زياد در اتمسفر اتاق انكوبه نمود.
ارگانيسم هائي كه رشد بهتري در حضور دي اكسيد كربن با غلظت بيشتر از هواي اتاق دارند كاپنوفيليك (Capnophilic) ناميده ميشوند. اين ارگانيسمها در اتمسفر CO2 با غلظت 5% تا 10% در يك انكوباتور ويژه با درهاي بدون درز و غير قابل نفوذ انكوبه ميشوند.
ارگانيسمهاي ميكروآئروفيل به فشار اكسيژن پائين تر از آنچه كه در اتمسفر اتاق وجود دارد احتياج دارند. با استفاده از جار شمعدان (Candle jar) به غلظت دي اكسيد كربن در حدود 3% ميتوان دست يافت. يك شمع سفيد كوچك را روشن كرده و در داخل جاري كه در آن محكم بسته ميشود قرار ميدهيم. شمع از اكسيژن محيط استفاده نموده و به علت پائين آمدن اكسيژن محيط خاموش ميگردد. محصولات اين احتراق آب و CO2 هستند كه هر دو از فاكتورهاي رشد ارگانيسم به حساب ميآيند. جار شمعدان اغلب جهت كشت نايسريا گنوره مورد استفاده قرار ميگيرد. محيطهاي كشتي نيز وجود دارند كه حاوي سيستمهاي توليد كننده CO2 ميباشند و جهت كشت نايسريا مورد استفاده قرار ميگيرند. يك قرص بيكربنات سديم در رطوبتي كه بوسيلة يك كيسه پلاستيكي ايجاد ميشود حل شده و مقدار مناسبي CO2 جهت رشد باكتري پاتوژن توليد ميكند. آگار با جلوگيري از جريان تبادلي هواي موجود در سطح مايع شرايط ميكروآئروفيليك كم (minimicroaerophilic) را در حدود 1 تا 2 سانتيمتر زير سطح محيط كشت فراهم ميكند. گونههاي لپتوسپيرا را ميتوان بدين طريق كشت داد.
روشهاي ايجاد شرايط اتمسفري بيهوازي در كشت اوليه
روشهاي مرسوم: سيستمي كه بطور معمول جهت ايجاد اتمسفرهاي اختصاصي بيهوازي و كاپنوفيليك مورد استفاده قرار ميگيرد جار بيهوازي است. جارهاي بيهوازي موجود شامل گاز پك (Gaspak) و غيره ميباشد. در اين سيستم از يك جار پلاستيكي سنگين و شفاف كه درب آن كاملا بسته شده و نسبت به هوا غير قابل نفوذ است، استفاده ميشود. ورود يك مخلوط گازي حاوي هيدروژن به جار باعث تركيب هيدروژن و اكسيژن و در نتيجه توليد آب و ايجاد شرايط بيهوازي ميگردد. كاتاليستهائي مركب از قرصهاي آلومينيومي پوشيده شده با پالاديوم كه در يك تور سيمي نگهداري ميگردند ترجيح داده ميشوند. از آنجائيكه خطر انفجار با اين كاتاليست سرد وجود ندارد بيشتر مورد استفاده قرار ميگيرد. اما قرصها در اثر رطوبت زياد و SH2 غيرفعال ميشوند، بنابراين بعد از هر بار استفاده بايد كيسههاي حاوي قرصهاي فلزي را تا 160 درجه سانتيگراد در يك فور بمدت 5/1 تا 2 ساعت حرارت داد تا احياء گردند، كاتاليستهاي فعال شده را بايد تا زمان استفاده مجدد در يك محيط خشك نگهداري نموده استفاده از جار بدون كاتاليست توصيه نميگردد.
جارهاي بيهوازي با دو روش متفاوت آماده ميشوند. ساده ترين روش (به صورت تجاري وجود دارد) استفاده از يك كيسه توليد كننده هيدروژن و CO2 ميباشد كه با اضافه كردن 10 ميلي ليتر آب فعال ميشود. درب كيسه را باز كرده و به همراه پليتها در جار قرار داده و به آن آب اضافه ميكنيم و سپس درب جار را كاملاً ميبنديم. در ظرف چند دقيقه گرما (با لمس جار مشخص ميشود) و پس از آن رطوبت در ديوارهها ايجاد شده كه نشانگر اين مطلب است كه سيستم كار خود را به طور مناسب انجام داده است. در طي 1 تا 2 ساعت شرايط احياء ايجاد ميشود، گرچه انديكاتورهاي متيلن بلو و رزازورين (Resazorin) پس از مدت طولانيتري بيرنگ ميگردند. روش جايگزين ديگر استفاده از سيستم تخليه – جايگزيني ميباشد. در اين روش هوا با فشار 25 اينچ (5/62 سانتيمتر) جيوه از جار خارج ميشود.
تكنيكهاي Roll-tube , PRAS : محيطهائي كه تحت شرايط بيهوازي توليد ميشوند، محيطهاي Pereduced anaerobically sterilized ناميده ميشوند. لولههاي PRAS بوسيلة مخلوط كردن تركيبات محيط و جوشاندن آن به منظور خارج ساختن هواي محلول و سپس خارج ساختن گازهاي آن با استفاده از يك گاز عاري از اكسيژن، ساخته ميشوند. در طي مراحل بعدي ساخت محيط (استريليزاسيون، تلقيح و كشت مجدد) بايد از ورود هوا به ظرف جلوگيري نمود. جهت پائين آوردن پتانسيل اكسيداسيون – احياء (Eh) محيط، قبل از استريليزاسيون يك مادة احياء كننده به محيط اضافه ميشود.
.: Weblog Themes By Pichak :.